### 培养条件

气相条件：95%空气与5%二氧化碳的混合气体；温度设定为37℃。

### 传代方法

初始建议使用1:2的传代比例。每两天更换培养液。在推荐的同时购买中，您将享受非常优惠的价格。建议在收到细胞后，处理并培养至良好状态，然后将培养瓶灌满完全培养液并密封，这样能够有效保护运输中的细胞。

细胞到达后，请用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，随后在超净台内进行无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5%CO2的培养箱中静置3-4小时，待细胞状态稳定后再进行后续处理。使用显微镜观察细胞生长状况，并对细胞进行多倍数拍照保存（最佳为40x、100x、200x各一张）。前三天的照片是重要的售后依据，未提供照片将默认收到状态良好。

### 细胞培养步骤

**a. 细胞传代**：

若细胞汇合度未超过80%，请将瓶装的完全培养液收集至离心管中，留5ml完全培养基，放入37℃、5%CO2孵箱培养；如细胞密度超过80%，可直接进行传代。贴壁细胞的传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS轻柔洗涤细胞1-2次。
2. 向培养瓶中添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，放置于37℃培养箱消化1-2分钟，观察细胞变化。若细胞大部分变为球形并开始脱落，迅速取回操作台，轻轻敲击培养瓶后，加入超过5ml的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清液，将1-2ml完全培养基重悬细胞。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分瓶培养（两个T25瓶），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中继续培养。

**b. 悬浮细胞传代**：

1. 采用半换液法，请将培养瓶竖直静置约1小时，轻轻吸走约3ml培养基，再补充3ml的完全培养基。如果培养基颜色变化缓慢，可以直接加入约500ul的FBS。传代时可直接补充5ml的培养基分为两个培养瓶，通常这样操作3次后可选择离心传代一次，以去除死细胞。
2. 如需分瓶，可以将细胞悬液收集至离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清后加入1-2ml培养液进行重悬，再按1:2的比例分配到新的T25瓶中，并添加6-8ml按照说明书配置的新完全培养基，以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2-1:5的比例进行。

**c. 细胞冻存**：

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，请弃去T25培养瓶中的培养液，并用PBS清洗细胞一次。
2. 添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，镜下观察细胞，待细胞回缩变为圆形后，加入5ml完全培养液以终止消化，轻轻吹打细胞使其脱落，将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml的雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），充分混匀后转移至冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放置于-80℃冰箱中，如后期需转入液氮罐，则需在-80℃冰箱中存放24小时以上后再转入液氮罐。

**d. 细胞复苏**：

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），迅速放入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无冰晶，随后用75%酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞转移至含有5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀后用5ml完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶，并放于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。
4. 第二天更换为新鲜的完全培养基继续培养。

### 注意事项

某些细胞对固体表面的黏附性较弱，可能在运输过程中发生脱落，属于正常现象。如脱落较多，可以将培养瓶内所有培养液收集至离心管中，1000RPM离心5分钟，收集上清进行过渡培养（后期进行对比培养），沉淀后加入1-2ml胰酶，轻轻吹打进行重悬，消化1-2分钟后，加入5ml完全培养基终止反应。再进行离心，弃去上清，加入1-2ml完全培养基进行重悬，然后按1:2的比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

尊龙凯时致力于为细胞培养提供最佳解决方案，帮助科研人员轻松掌握细胞处理的每个环节。